舞台は、総人口の半分が失われたという地球規模の大災害「セカンドインパクト」から15年後の世界。主人公の碇シンジは、3年間会っていなかった父ゲンドウに呼び出され第3新東京市にやって来るが、その途中、巨大な謎の生命体「使徒」（第4使徒）と国連軍との戦闘に巻き込まれる。第3新東京市の地下空間「ジオフロント」に存在する国連直属の特務機関「NERV」の最高司令であるゲンドウは、NERV本部に到着したシンジに、NERVが開発した汎用ヒト型決戦兵器・人造人間「エヴァンゲリオン」の一体、初号機を見せ、そのパイロットとなって使徒と戦うことを強いる。シンジは出来るわけがないと拒むが、もう一人のパイロット・綾波レイの重傷を目にし、エヴァに乗ることを決める。シンジは、エヴァ初号機を歩かせることに成功するが、2歩目で転んだところを第4使徒に捕まえられ、腕と頭部を破壊される。しかし初号機は暴走を起こして使徒を圧倒、最後は使徒が自爆する。

シンジは、上司の葛城ミサトの家に同居することになった。中学校では鈴原トウジから、先の戦闘で妹が怪我をしたという理由で殴られ、乗りたくて乗っているわけではないシンジは、自分がパイロットである理由を自問する。まもなく第5使徒が現れ、シンジは初号機で迎撃するも、ビルをも容易く切断する使徒の触手に追われ、補給電線のアンビリカルケーブルをも切断される。さらに山の中腹へと投げ飛ばされるが、そこにはシェルターを抜け出し、戦闘を見物に来ていたトウジと相田ケンスケがいた。シンジはエントリープラグへ二人を避難させると、ミサトの退避命令を無視して初号機にナイフを持たせ、使徒へと突撃する。初号機は腹を使徒の触手で貫かれつつも、ナイフを使徒のコアに突き立てその殲滅に成功する。命令無視をミサトに咎められたシンジはミサトの家を出るが、追跡していたNERVの保安部によりNERV本部へと連行される。「誰のためでもなく自分の意志で乗るのかどうか決めなさい」とミサトに言われたシンジは、改めてその意味を考える。

その後、第3新東京市に第6使徒が襲来。シンジは初号機で出撃するが、遠距離から使徒が放った光線により負傷する。破損した初号機が回収された後、使徒はジオフロントに向け地表装甲盤の掘削を始める。攻防ともに強力で守備範囲の広大な使徒に対し、ミサトは遠距離からエヴァの陽電子砲による狙撃作戦「ヤシマ作戦」を立案・実行するが、死ぬ思いをしたシンジはエヴァへの搭乗を拒む。ミサトはシンジにジオフロント深部に置かれている第2の使徒「リリス」を見せ、リリスと使徒との接触による「サードインパクト」を防ぐため、職員全員が使徒と刺し違える（最悪の場合は本部ごと自爆する）覚悟でいると言い、シンジは再びエヴァに乗ることを了解する。囮として使徒への集中砲撃が行われる中、日本全土の電力を接収しての陽電子砲の一撃は、使徒に命中するが、致命傷とはならず反撃される。シンジは恐怖に震え、ゲンドウはシンジが役に立たないと判断、砲手をレイに変えようとするが、ミサトは彼を信じ託すべきと主張しそれが認められる。2射目の準備を始めるシンジを、再度使徒の光線が襲うが、レイの乗る零号機が盾でこれを防ぎ、初号機の撃った陽電子砲の2射目によって第6使徒は殲滅された。

一方、月面では渚カヲルが棺から目覚めていた。

ヱヴァンゲリヲン新劇場版：序 - wikipedia